北京有那家医院治白癜风 http://m.39.net/pf/bdfyy/作者：赵曼丽[1]赵云[1]沈志鹏[2]顾伟忠[1]刘蕾[1]舒艳[1]张道恩[3]汤宏峰[1]
期刊：《中华病理学杂志》年49卷1期52-56页
目的：探讨间变性淋巴瘤激酶（ALK）克隆号1A4抗体在儿童髓母细胞瘤中的表达及意义。
方法：采用NanoString技术和测序技术对浙江大医院至年诊治的44例儿童髓母细胞瘤标本进行分子分型鉴定，同时应用免疫组织化学EnVision二步法检测ALK在44例髓母细胞瘤整张切片中的表达，统计分析蛋白表达与分子分型的关系。
结果：患者年龄范围0.5-13.0岁，平均年龄5.8岁。男性28例，女性16例。经典型31例，促纤维增生/结节型5例，广泛结节型3例，大细胞/间变型5例。44例儿童髓母细胞瘤除3例无确切划分亚型外，其余41例中5例为WNT型，12例为SHH型，9例为Group3型，15例为Group4型。44例肿瘤组织中13例ALK免疫组织化学阳性，阳性率为29.5%，其中强阳性6例、弱阳性7例。ALK蛋白表达与WNT型相关（P0.01）。WNT型中特征性出现核旁点状阳性。
结论：ALK克隆号1A4免疫组织化学可辅助儿童髓母细胞瘤分子分型，强阳性且出现核旁点状阳性提示WNT亚型。
髓母细胞瘤是儿童最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，约占儿童颅内肿瘤的20%。新近研究发现髓母细胞瘤至少可以分为4个分子亚型：WNT型（WNTsubgroup）、SHH型（SonicHedgehogsubgroup）、Group3型和Group4型［1］。间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因编码酪氨酸蛋白激酶受体，在神经系统发育过程中起着重要作用。ALK基因重组、突变或者扩增被发现在一系列肿瘤中，包括间变性大细胞淋巴瘤、神经母细胞瘤和非小细胞肺癌等［2］。新近?astowska等［3］运用克隆号D5F3抗体，发现ALK表达可以作为WNT型新的标志物，并可以作为良好预后的指标。ALK有多种免疫组织化学抗体型号，除D5F3外，还有ALK1、1A4和5A4等，不同克隆号之间表达有差异。克隆号1A4抗体是新的、灵敏度高的ALK抗体，已应用在肺癌中［4］，并且相对其他克隆号，其具有经济、方便等特点。本研究探讨ALK1A4抗体在儿童髓母细胞瘤表达情况。
1.病例资料：收集浙江大医院至年诊治的髓母细胞瘤44例。组织学分型依据版WHO中枢神经系统肿瘤分类［5］，由2位高年资病理医师阅片分析。将髓母细胞瘤分为经典型、促纤维增生/结节型、广泛结节型和大细胞/间变型4种组织学形态。
2.髓母细胞瘤分子分型：（1）NanoStringnCounter分子检测平台检测23例髓母细胞瘤病例。使用PromegaReliaPrepTMFFPE总RNA提取系统从甲醛固定石蜡包埋切片中提取总RNA，依照说明书操作。使用QuantiFluor?RNASystem检测RNA质量。依照Northcott等［6］描述，22个基因和3个看家基因（ACTB、GAPDH和LDHA）用于分组检测。（2）其余21例髓母细胞瘤分子分型检测：依照文献报道髓母细胞瘤各亚型的基因改变［7］，检测39个相关基因的的点突变、插入、缺失和5个基因拷贝数变异，并通过低深度全基因组测序检测大片段缺失/扩增结果，利用特有算法（如逻辑回归模型和随机森林模型），预测髓母细胞瘤4种分子分型的概率值，该部分由北京泛生子公司完成。
3.免疫组织化学染色：标本均经3.7%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，采用EnVision二步法，DAB显色。抗体ALK（克隆号：1A4，即用型）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。运用3DHISTECH数字病理平台扫描整张切片，由2位高年资病理医师独立分析结果。阳性产物定位于细胞质，以细胞质出现棕*着色及棕*色颗粒状物为阳性。阳性半定量标准依照文献所述［3］：0（阴性）：0-10%肿瘤细胞阳性；1+（弱阳性）：11%-50%肿瘤细胞阳性；2+（强阳性）：51%-%肿瘤细胞阳性。
4.荧光原位杂交（FISH）：标本经常规处理后，切3~4μm石蜡切片，采用荧光原位杂交ALK断裂试剂盒和ALK扩增试剂盒（为红绿双色探针，均购自广州安必平医药科技有限公司）分别检测髓母细胞瘤ALK基因断裂和扩增情况。大体流程：常规烤片及脱蜡后，将待检测的切片放于ThermoBriteElite自动FISH染色机（德国徕卡公司），依次进行预处理、杂交及洗脱。切片经DAPI复染，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察结果。结果判定：（1）对ALK断裂检测，红绿信号分离距离1个信号点或者单红信号判断为分离，计数个肿瘤细胞，15%的细胞出现分离信号，判断ALK断裂阳性；（2）对ALK扩增检测，计数50个肿瘤细胞，以红色信号（ALK）与绿色信号（LAF4）比值大于4为阳性。
5.统计学方法：采用SPSS25.0软件进行数据处理，计数资料的比较采用Fisher确切检验；用Kaplan-Meier法计算总生存率，生存率的比较采用Log-rank检验。P0.05示差异具有统计学意义。
1.临床病理资料和组织学特征：44例髓母细胞瘤患者，年龄范围0.5-13.0岁，平均年龄5.8岁；年龄3岁12例，≥3岁32例；男性28例，女性16例，男女比为1.8︰1.0；经典型31例，促纤维增生/结节型5例，广泛结节型3例，大细胞/间变型5例。
2.髓母细胞瘤分子分组：23例髓母细胞瘤经NanoString方法分组，4例WNT型、7例SHH型、7例Group3型、5例Group4型（图1）；21例髓母细胞瘤由北京泛生子公司完成，1例WNT型、5例SHH型、2例Group3型、10例Group4型，另有3例未发现任何基因改变，未归入任何一组，定为NEC型。共计5例为WNT型、12例为SHH型、9例为Group3型、15例为Group4型，3例为NEC型。
3.ALK免疫组织化学表达：ALK在各组间的表达情况和所有阳性患者信息详见表1。44例髓母细胞瘤中有13例ALK阳性，占29.5%，其中强阳性（2+）6例，弱阳性（1+）7例。ALK免疫表达在性别、年龄分组、组织学分型和分子分型各组间差异具有统计学意义（P值均0.05）。ALK免疫表达与WNT型具有强相关性（P0.01），所有5例WNT型ALK表达均强阳性，为细胞质棕*色着色，其中4例还出现核旁深棕色点状着色（图2）；另1例SHH型强阳性，为细胞质内棕*色着色，未见核旁点状阳性；所有6例强阳性患者组织学类型均为经典型，年龄均3岁，1例男孩，5例女孩。7例弱阳性患者中，3例为SHH型、1例Group3型、1例Group4型、2例NEC型；组织学类型为2例经典型、3例促纤维增生/结节型和2例广泛结节型，未见大细胞/间变型；年龄均3岁。在促纤维增生/结节型和广泛结节型标本中阳性染色在结节间细胞，结节内细胞阴性。7例弱阳性均为细胞质内着色，未见核旁点状阳性。
4.FISH检测：挑选4例免疫组织化学强阳性标本（1例SHH型和3例WNT型），经ALK断裂及扩增检测，均阴性，未发现ALK基因断裂或扩增。
5.生存分析：有随访资料的35例髓母细胞瘤患儿7例死亡，28例存活；最长生存50个月，最短1个月，平均生存时间19.8个月，中位生存时间16.1个月。Kaplan-Meier生存分析显示ALK强阳性预后较好，ALK阴性预后较差，ALK弱阳性居中，但三者的生存曲线差异无统计学意义（P=0.；图3）。
髓母细胞瘤的临床表现具有明显的异质性，WNT型预后最好，Group3型预后最差，SHH型和Group4型的预后相似［8］。依据不同亚型，给予不同强度的治疗，可以在治疗疾病的同时减少对患者的损害，以提高患者的生存质量。目前，有多种方法可对髓母细胞瘤进行分子分型，如NanoStringnCounter技术、基因测序、甲基化检测及microRNA检测等［6，9-10］，不同检测方法结果大致一致。但是由于技术或设备等原因，以上方法不能用于所有的临床病理实验室中。免疫组织化学检测方便、经济，已广泛用于临床病理工作中。目前，也可以使用免疫组织化学抗体，如GAB1、β-catenin、filaminA和YAP1，联合FISH和PCR技术［11］，对髓母细胞瘤进行初步分型。其中WNT型：β-catenin和YAP1阳性，GAB1阴性；SHH型：GAB1和YAP1阳性，β-catenin阴性；非WNT/SHH型：β-catenin、GAB1和YAP1阴性。
ALK基因改变可出现在多种肿瘤中，ALK基因过表达在间变性大细胞淋巴瘤提示预后较好，而在横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤中则提示预后差［2］。?astowska等［3］报道ALK基因过表达是髓母细胞瘤预后良好的指标，使用克隆号D5F3的ALK免疫组织化学可作为WNT型的分型标志物。本研究调查ALK克隆号1A4抗体在髓母细胞瘤的表达情况，相对克隆号D5F3，克隆号1A4抗体更加便宜，因此可广泛使用于病理诊断中。在本组研究中，44例髓母细胞瘤中有13例ALK阳性，阳性率29.5%，相对文献报道例中25例阳性（21.6%）［3］，总阳性率较高。在本组研究中有6例强阳性患者，包含所有5例WNT型和1例SHH型。WNT型肿瘤组织ALK阳性均大于50%，染色呈深棕色，5例中有4例还出现核旁点状阳性，这可能是克隆号1A4特有的染色特点，未出现在克隆号D5F3中［3］。本组研究中有7例弱阳性患者，分子分组为非WNT型，组织学类型有经典型、促纤维增生/结节型和广泛结节型，无大细胞/间变型，但是文献报道中所有组织学类型均可阳性。克隆号1A4抗体在非WNT型中阳性比例较高（8/13），提示相对克隆号D5F3其特异性较差。因此我们建议大于50%的肿瘤细胞阳性，且出现核旁点状阳性，提示为WNT型。ALK免疫组织化学可以与β?catenin等免疫组织化学联合使用，进行髓母细胞瘤分子分组，尤其在部分病例β?catenin核染色难以判断时。除WNT型强阳性外，还有1例SHH型强阳性染色，因此ALK染色不是WNT型的特异性指标，需与其他免疫组织化学联合使用。
在非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤和炎性肌纤维母细胞瘤等肿瘤中，ALK基因与不同伙伴基因重组，产生ALK免疫组织化学胞质或核阳性［2］。在本组研究中，我们挑选4例ALK强阳性的标本，用FISH方法检测ALK基因断裂和扩增情况，并未发现ALK基因断裂或者扩增。Trubicka等［12］和Coco等［13］分别评估64例和52例髓母细胞瘤ALK基因突变情况，各发现1个基因变异，其中ALK基因变异c.AT发生在WNT型患者中；而另外的研究未发现任何热点突变［14］。我们由于条件的限制，未做ALK基因突变检测。ALK在WNT型中过表达的机制尚未清楚，可能是协同Wnt通路上的其他基因。
?astowska等［3］发现ALK强阳性可以单独的作为预后良好的指标。在本组研究中，我们随访到36例患者，随访时间1-50个月不等，其中ALK强阳性患者4例，弱阳性7例，阴性24例。生存分析图显示ALK强阳性预后较好，阴性预后较差，弱阳性居中，但三者的生存曲线差异无统计学意义，这可能和我们的随访时间短和例数较少有关，因此需要更多样本和更长时间随访来验证。因为WNT型是预后良好的髓母细胞瘤亚型，ALK强阳性与WNT型相关，提示是预后良好的因素。在本研究中，另一ALK强阳性患者为SHH型，该患者随访13个月，无复发和转移。
综上所述，我们评估了ALK克隆号1A4抗体在儿童髓母细胞瘤中表达情况，相对克隆号D5F3其总表达率较高，但其特异性较差。强阳性表达与WNT型相关，WNT型出现核旁点状染色。ALK是一个有用的生物标志物，可联合其他免疫组织化学抗体用于髓母细胞瘤WNT型分型。ALK在髓母细胞瘤表达机制还有待研究。
更多阅读：
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原发性中枢神经系统肿瘤的免疫组化标记物研究进展
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